Il microscopio confocale, se paragonato ad un modello ottico convenzionale, vanta prestazioni sicuramente superiori. Le immagini bidimensionali risultano più nitide rispetto a quelle che vengono acquisite con un microscopio classico. In questa guida proveremo ad illustrarvi il funzionamento di tale apparecchio che consente di effettuare anche le ricostruzioni tridimensionali dei campioni che si esaminano. Restate collegati per saperne di più e per scegliere il modello che più risponde alle vostre esigenze.
Come funziona
I microscopi confocali sono caratterizzati da un sistema di lenti e specchi che permettono di esaminare il campione sotto osservazione. La luce sprigionata dal campione viene messa a fuoco attraverso l’obiettivo del microscopio e captata da un sistema di fotomoltiplicatori. In questo modo si viene a creare l’immagine finale che osserviamo.
L’immagine finale deriva dalla luce generata da una piccola sezione del campione, ossia quella più vicina al piano a fuoco, e solo in piccola parte da quella proveniente dai piani fuori fuoco.
Per essere più chiari: l’immagine finale altro non è che una sezione del campione osservato, Se, dunque, cambiamo il piano a fuoco, possiamo acquisire altre immagini di altrettante sezioni del campione. Ecco, allora, che l’insieme di tutte queste sezioni darà vita a ricostruzioni tridimensionali del campione.
Perché usarlo?
Un microscopio confocale a scansione laser viene prediletto rispetto ad altre apparecchiature perché la sua tecnica non è affatto distruttiva e soprattutto i dati vengono rilevati ad una velocità massima. Inoltre questo strumento permette di esaminare aree molto piccole.
Con un microscopio confocale è possibile osservare anche campioni pari a poche decine di micron a lato
Inoltre i microscopi confocali sono capaci di operare in due modalità differenti: riflessione e fluorescenza. Tali strumenti scientifici, inoltre, sono in grado di ridurre le informazioni che derivano dai piani non a fuoco attraverso i pinhole.
I modelli
Di microscopi confocali in commercio ve ne sono tanti. Due le tipologie principali in circolazione: i modelli a scansione laser e i microscopi confocali ed interferometrici. Entrambe le apparecchiature presentano in dotazione un pc integrato con software naturalmente compatibili con Windows.
Di seguito le differenze tra le due tipologie di microscopi confocali:
- I microscopi confocali ed interferometrici vengono adoperati per acquisire immagini topografiche tridimensionali. Vantano una tecnologia confocale e tecniche di interferometria.
- I microscopi confocali ed interferometrici differiscono dai tradizionali microscopi confocali a scansione laser grazie alla sorgente luminosa: una luce bianca al posto del laser. Tale luce viene emessa da un Led e la sua intensità risulta regolabile.
- I microscopi confocali ed interferometrici non prevedono il sezionamento ottico al contrario dei modelli confocali,
- Le immagini dei microscopi confocali ed interferometrici vengono catturare sia come bidimensionali che come tridimensionali.
- I microscopi confocali a scansione laser presentano un metodo di osservazione sia di riflessione che fluorescenza; i microscopi confocali ed interferometrici hanno un metodo di osservazione di riflessione.
- Con i microscopi confocali ed interferometrici non è prevista la preparazione del campione al contrario dei modelli confocali a scansione laser.
- I microscopi confocali ed interferometrici sono attrezzature scientifiche adatte a rilevare la rugosità della superficie in maniera molto dettagliata. Se i microscopi confocali a scansione laser ne rilevano in modo profondo la porosità, i modelli confocali ed interferometrici invece soltanto la porosità in superficie.
- Con i microscopi confocali a scansione laser si riesce a ricostruire la struttura interna dei campioni esaminati grazie al sezionamento ottico dell’oggetto osservato. Con i microscopi confocali ed interferometrici invece le ricostruzioni sono di tipo superficiale ma risultano adatti per misurare la rugosità della superficie.
- Con i microscopi confocali ed interferometrici si possono osservare sia sezioni sottili di campione che campioni di misure fino a qualche centimetro.
Le componenti
I microscopi confocali a scansione laser sono caratterizzati da una serie di importanti elementi. Una delle componenti principali è rappresentata dalla sorgente luminosa che altro non è che un raggio laser monocromatico.
La lunghezza d’onda cambia in base alla sorgente del laser e può essere cambiata tramite un software.
Un altro elemento importante che caratterizza tali apparecchiature è il Primo Pinhole, ossia il foro stenopeico che permette di illuminare una piccola parte del campione. La sua “mission” è generare la sorgente luminosa. Fondamentale anche lo Specchio Dicroico che permette di distinguere la luce di eccitazione da quella di emissione.
Tra le componenti c’è poi il portacampione, ossia il piattino su cui poggiamo l’oggetto da osservare, e il Secondo Pinhole, che permette di cancellare i raggi che derivano da piani fuori fuoco. Con il rilevatore il segnale viene trasmesso al pc e si dà in questo modo il via all’acquisizione dei vari dati.
Sia il rilevatore che la sorgente di un microscopio confocale sono collegati al computer tramite la fibra ottica. Con il pc, inoltre, è possibile modificare i parametri: il tipo di laser utilizzato, la metodologia di osservazione che può essere sia di riflessione che di fluorescenza.
La ricostruzione in 3D delle immagini che abbiamo acquisito con il microscopio può avvenire mediante un software. Tali ricostruzioni sono sia longitudinali che trasversali; la scelta va fatta in base alle rispettive esigenze.
Gli anelli colorati
Solitamente sull’obiettivo del microscopio è presente un anello colorato che indica il suo ingrandimento. La corrispondenza tra colori e ingrandimento dell’obiettivo varia a seconda dei produttori. Negli obiettivi ad immersione c’è anche un secondo anello il cui colore indica il liquido di immersione che è stato usato. Ad esempio: nero per l’olio, bianco per l’acqua, arancio per glicerolo e così via.
Un altro ruolo determinante nel caso di microscopi confocali è quello assegnato ai software che sono funzionali ad elaborare i dati e a verificare, al contempo, i parametri di funzionamento del dispositivo. I sofware servono anche a selezionare le tipologie di zoom e di laser usati e l’intensità della sorgente luminosa.
Conclusioni
In questo articolo abbiamo esaminato la funzionalità, le caratteristiche e le componenti di un microscopio confocale che viene considerato tra gli apparecchi più prestanti di questo genere.
Non bisogna, naturalmente, trascurare anche qualche punto debole; i microscopi confocali a scansione laser non riescono, ad esempio, a lavorare per bene in riflessione su materiali trasparenti. In questi casi capita, infatti, che non ci sia abbastanza luce per avviare la scansione.
