Il microscopio confocale risulta avere prestazioni superiori se messo a confronto con un tradizionale microscopio ottico. Le immagini bidimensionali sono, infatti, molto più chiare di quelle ottenute con un classico microscopio. Il valore aggiunto, inoltre, di un microscopio confocale sta nelle ricostruzioni tridimensionali dei campioni che si stanno esaminando.
In questo articolo ci soffermeremo su questa tipologia di microscopio, analizzando anche la sua modalità di funzionamento. Faremo poi un’ulteriore distinzione tra i microscopi confocali a scansione laser e i microscopi confocali ed interferometrici. Se siete appassionati di scienza e microscopia, restate collegati!
Come si usa
Il microscopio confocale si basa su un tipo di funzionamento non distruttivo che comporta il sezionamento ottico di un campione. Tale tecnica prevede che venga illuminato soltanto il piano focale che si osserva in modo che vengano acquisite immagini disposte su piani focali differenti e che la risoluzione dell’immagine risulti più alta. Non ci sono parti dell’immagine disturbate perché derivanti da piani non a fuoco.
I microscopi confocali fanno uso di una sorgente luminosa caratterizzata da una radiazione laser in grado di scansionare il campione che si sta esaminando.
I modelli più gettonati, appartenenti a questa categoria, prendono infatti il nome di microscopi confocali a scansione laser. L’acronimo è CLSM (Confocal Laser Scanning Microscope). Si tratta di apparecchiature utilizzate soprattutto in campo scientifico e ancor più precisamente in campo biomedico.
La luce, prodotta dal piano a fuoco, viene raccolta dal sistema di fotomoltiplicatori, in modo da creare l’immagine finale che osserviamo. L’immagine finale, dunque, è generata per lo più dalla luce che proviene da una piccola sezione del campione, ossia quella vicina al piano a fuoco, e solo in piccola parte da quella che ha origine dai piani fuori fuoco.
L’immagine finale è la chiara e nitida rappresentazione di una parte di un campione sotto osservazione. Se si cambia il piano a fuoco si possono ottenere immagini di altre sezioni del campione: l’insieme di tutte queste sezioni permette di creare ricostruzioni tridimensionali del campione.
La fluorescenza può essere tipica del materiale che stiamo analizzando; in questo caso si parlerà allora di autofluorescenza. Quando, invece, la fluorescenza viene generata attraverso degli specifici coloranti che si uniscono al campione si parlerà di fluorocromi. Queste ultime sostanze vengono utilizzate maggiormente per la ricerca biomedica in quanto attraversano le cellule e, mediante reazioni chimiche, consentono l’emissione della
fluorescenza dalle cellule.
Per lavorare in fluorescenza dobbiamo prendere in considerazione le lunghezze d’onda del laser che stiamo usando ed il tipo di liquido. Inoltre dobbiamo anche usare un’intensità laser giusta in modo da scongiurare lo spegnimento dei fluorocromi. Tale fenomeno prende nome di bleaching.
Non bisogna far uso di fluorocromi quando si ha a che fare con materiali autofluorescenti.
Com’è fatto
Il microscopio confocale a scansione laser è caratterizzato da una serie di componenti, ognuna fondamentale ai fini del funzionamento dello strumento scientifico.
I suoi principali elementi sono:
- Sorgente luminosa: è composta da un raggio laser monocromatico. La lunghezza d’onda varia a seconda della sorgente laser che può comunque essere modificata mediante un software. Per assicurare una giusta intensità, il raggio luminoso viene filtrato in un primo momento.
- Primo Pinhole: è il foro stenopeico, ossia il disco forato che consente di illuminare una piccola parte del campione. La sua funzione è quella di dare origine ad una sorgente luminosa.
- Specchio Dicroico: consente di dividere la luce di eccitazione da quella di emissione. Può inoltre essere capace di riflettere la luce sotto una certa lunghezza d’onda, nonché essere attraversato dalla luce con lunghezze d’onda maggiori.
- Portacampione: è la base su cui viene appoggiato il campione. Il piattino può essere spostato con piccoli movimenti meccanici.
- Secondo Pinhole: è la componente del microscopio confocale a scansione laser che consente di cancellare i raggi provenienti dai piani fuori fuoco;
- Rilevatore: quando arriva il segnale al rilevatore, viene trasformato in digitale e trasmesso al pc in modo da procedere con l’acquisizione dei dati e delle informazioni.
La sorgente ed il rilevatore di un microscopio confocale sono connessi al personal computer mediante la fibra ottica. Il pc è una delle componenti più importanti di questo tipo di microscopio perché consente di cambiare i parametri, a partire dal tipo di laser usato sino ad arrivare alla metodologia di osservazione che può essere sia di riflessione che di fluorescenza.
Il microscopio è connesso al pc mediante una telecamera che trasmette le immagini di ciò che si sta osservando in modo che si possano visualizzare in tempo reale sullo schermo.
Lo step successivo prevede la ricostruzione in 3D delle immagini raccolte; tale operazione avviene mediante uno specifico software. Le ricostruzioni possono essere sia trasversali che longitudinali a seconda delle esigenze e delle necessità.
I vantaggi e i limiti
I vantaggi di usare un microscopio confocale a scansione laser sono davvero tanti. Ve ne elenchiamo alcuni in modo da rendere più chiara l’importanza di usare un simile apparecchio scientifico:
- la tecnica non è distruttiva;
- il rilevamento dei dati avviene ad un’elevata velocità;
- l’area esaminata è molto piccola. Può essere anche pari a poche decine di micron a lato:
- il microscopio confocale a scansione laser è in grado di ridurre l’informazione che proviene dai piani non a fuoco mediante i pinhole;
- questo apparecchio può lavorare in due modi diversi: sia in riflessione che in fluorescenza.
Non manca, naturalmente, qualche limite. Tra i punti deboli di un microscopio confocale a scansione laser c’è il fatto che, se si lavora in riflessione su materiali non trasparenti, non si riesce a superare profondità di alcune decine di micron perché non si ha la luce sufficiente per procedere alla scansione.
Tipologie di microscopio confocale
I microscopi confocali possono dividersi in due categorie: i microscopi confocali a scansione laser e i microscopi confocali ed interferometrici. Entrambi sono caratterizzati da un pc integrato con software compatibili con Windows. Diversi gli aspetti che li differenziano l’uno dall’altro.
I microscopi confocali ed interferometrici sono caratterizzati da una tecnologia confocale e da tecniche di interferometria. Si tratta di strumenti usati per acquisire immagini topografiche tridimensionali.
I microscopi confocali ed interferometrici si differenziano dai classici microscopi confocali a scansione laser perché la sorgente luminosa che viene usata è la luce bianca (non il laser ndr) che viene emessa dal led e la cui intensità è regolabile. Inoltre questi apparecchi non consentono il sezionamento ottico a differenza dei modelli esaminati in precedenza. Questi microscopi sono manovrati mediante dei software integrati nel computer. Le immagini del campione possono essere catturate sia come bidimensionali che tridimensionali.
Il metodo di osservazione di un microscopio confocale a scansione laser è di riflessione o fluorescenza, mentre quello di un microscopio confocale ed interferometrico è solo di riflessione.
Le ricostruzioni 3D sono previste anche nel caso si faccia uso di un microscopio confocale ed interferometrico ma solo se si fa riferimento alla superficie. La sorgente luminosa non è rappresentata dal laser ma dalla luce bianca del Led. La preparazione del campione, prevista nel caso dei microscopi confocali a scansione laser, non è necessaria nei casi di microscopi confocali ed interferometrici. Le dimensioni dei campioni sono standard nel primo caso mentre per la seconda categoria di microscopi le dimensioni possono essere nanometriche e centimetriche.
I microscopi confocali ed interferometrici consentono di rilevare la quantificazione della rugosità della superficie in modo più specifico dei microscopi confocali a scansione laser. Questi ultimi però riescono a rilevare, invece, in modo più profondo la porosità. I microscopi confocali ed interferometrici rivelano solo la porosità superficiale.
I microscopi confocali a scansione laser consentono, mediante il sezionamento ottico del campione, di ricostruire la struttura interna degli oggetti esaminati. I microscopi confocali ed interferometrici si occupano di effettuare ricostruzioni di superfici e sono ideali soprattutto per misurare la rugosità di superficie.
I microscopi confocali a scansione laser necessitano di campioni preparati su sezioni sottili mentre con i microscopi confocali ed interferometrici si possono usare sia sezioni sottili che campioni di dimensioni fino a qualche centimetro.
I software
I software hanno un compito molto importante quando si ha tra le mani un microscopio confocale. Servono ad elaborare i dati ma prima anche a controllare i parametri di funzionamento dell’apparecchio scientifico. Con questi software è possibile impostare, infatti, lo zoom, il tipo di laser usato, il tipo di indagine, l’intensità della sorgente luminosa.
I software servono inoltre anche ad elaborare i dati, mediante ricostruzioni 3D, sezioni ottiche, tipo di rugosità. Alcuni di questi programmi consentono, infine, di inserire testo, frecce, forme alle immagini catturate dal nostro microscopio durante l’analisi dei campioni da esaminare.
