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Frutto di una lunga evoluzione, il microscopio, grazie alla sua capacità di scandagliare l’infinitamente piccolo, affascina l’umanità fin dalla sua nascita, alla fine del XVI secolo. Per la maggior parte di noi si tratta di uno strumento che, in modo quasi magico, consente di analizzare microrganismi. Per chi della microscopia ha fatto il suo lavoro, invece, il microscopio non ha segreti. E non solo, chi utilizza questo apparecchio per lavoro, sa benissimo che non tutti i microscopi sono uguali e che ogni disciplina scientifica richiede un apparecchio apposito. In questo articolo prenderemo in considerazione, in particolare, il microscopio ottico a fluorescenza.
Un microscopio per ogni uso
Prima di entrare nell’analisi specifica del microscopio ottico a fluorescenza, è necessario fare chiarezza sui diversi tipi di microscopi in commercio. Attribuita dai più a Galileo Galilei, la nascita del microscopio è in realtà controversa. Alcuni studiosi attribuiscono la paternità della scoperta all’olandese Zacaria Jannes il quale, intorno al 1595, avrebbe realizzato un rudimentale microscopio con tre tubi che scorrevano l’uno dentro l’altro. Certo è che Galileo Galilei ne realizzo un protopico che chiamò “occhialino per vedere cose minime”. In ogni caso, nel corso dei 200 anni successivi, pur con qualche miglioria, il microscopio non ha subito evoluzioni significative.
Un vero di salto di qualità, è stato fatto solo all’inizio del XIX secolo quando il microscopio ottico si è imposto come strumento indispensabile in tutti i laboratori di anatomia. Decisamente più moderno e sofisticato è il microscopio elettronico. Inventato dal fisico tedesco Ernst Kuska e dall’ingegnere americano Max Knoll nel 1931, è un apparecchio capace di ingrandimenti notevolmente superiori a quelli raggiungibili con il microscopio ottico, e decisamente più sofisticato. Chiarita la differenza fra microscopio elettronico e microscopio ottico, entriamo ora nello specifico di quest’ultimo, analizzando le differenze, talvolta sostanziali, fra i diversi apparecchi. Il più comune, adatto anche a uso hobbistico, è il microscopio ottico, meccanico o digitale. Molto più sofisticato e particolarmente vocato ad essere utilizzato in biologia, è invece, il microscopio ottico a fluorescenza.
Cos’è la fluorescenza
Il termine fluorescenza deriva dalla fluorite, un minerale che, quando viene colpito dalla luce, emette a sua volta luce. Questa proprietà, tipica anche di altri materiali detti, appunto fluorescenti, ha costituito una scoperta fondamentale per la microscopia. Grazie alla fluorescenza, infatti, è possibile distinguere cellule diverse all’interno dello stesso campione.
La fluorescenza si differenzia dalla fosforescenza per la diversa reazione alla luce. I minerali fluorescenti cessano l’emissione di luce nel momento esatto in cui cessa lo stimolo luminoso che li colpisce. I materiali fosforescenti, invece, accumulano la luce ricevuta e continuano a emetterla per un certo periodo anche dopo la cessione dello stimolo luminoso.
Come funziona il microscopio ottico a fluorescenza
Il microscopio ottico, come sappiamo, utilizza la luce visibile per catturare l’immagine del campione posto sotto l’obiettivo e trasmetterla all’oculare.
Il microscopio a fluorescenza utilizza i raggi ultravioletti e amplifica l’efficienza della luce grazie alle proprietà fluorescenti dei minerali (detti fluorocromi) che vengono aggiunti ai campioni. Il microrganismo così trattato, reagisce ai raggi ultravioletti (quelli a cui meglio reagiscono i minerali fluorescenti), emettendo a sua volta luce.
Va precisato che non tutte le cellule reagiscono allo stesso modo ai fluorocromi e che non tutti i fluorocromi sono uguali. Questo concetto è importante per capire come funzioni effettivamente il microscopio a fluorescenza e come cellule diverse di uno stesso campione, possano essere identificate grazie a colorazioni diverse. Utilizzando diversi tipi di fluorocromi, quindi, l’osservatore, può distinguere, per esempio, le cellule sane da quelle malate all’interno di un singolo campione. Va anche detto che l’osservatore che utilizza un microscopio a fluorescenza, analizza la luce emessa dal campione, non la luce che attraversa il campione come, invece, avviene con il microscopio ottico tradizionale.
Elementi che lo caratterizzano
Il microscopio a fluorescenza è un microscopio ottico che utilizza la luce ultravioletta per analizzare microrganismi. L’osservazione avviene utilizzando le proprietà fluorescenti e fosforescenti dei minerali con cui i campioni vengono messi a contatto. Ciò premesso, si deduce che questo tipo di microscopio necessiti di una lampada che generi luce ultravioletta. Vediamo quindi, quali siano i componenti specifici del microscopio ottico a fluorescenza:
- Lampada ad arco a vapori di mercurio: che emette luce ultravioletta;
- Filtro di eccitazione: viene utilizzato dall’osservatore, per regolare la lunghezza d’onda della luce ultravioletta. La lunghezza d’onda scelta determina il colore con cui si presenta il campione che può presentarsi: verde, rosso o blu.
- Condensatore a campo scuro: è un sistema di lenti che convoglia la luce verso l’obiettivo e, dall’obiettivo all’oculare. Nel microscopio ottico tradizionale è a sfondo bianco; nel microscopio a fluorescenza, invece, si preferisce il condensatore a campo scuro per favorire il contrasto con il campione che si sta analizzando. Gli organismi trattati con il fluorocromo e sottoposti a luce violetta, assumono i colori: verde, rosso, o blu, a seconda della lunghezza d’onda utilizzata.
- Filtro di sbarramento: è un accessorio indispensabile per la sicurezza dell’operatore. Consiste in un filtro giallo in plexiglass o altro materiale trasparente appositamente trattato, che serve a proteggere gli occhi dalla luce ultravioletta. Il contatto, anche minimo con i raggi ultravioletti, infatti, potrebbe danneggiare in modo irreversibile la vista.
Per il resto, il microscopio elettronico è a tutti gli effetti un microscopio ottico, dotato di obiettivi e oculare.La regola base al momento della scelta dell’apparecchio da acquistare, quindi è la stessa: assicurarsi che le lenti siano di qualità.
Maggiore è la qualità delle lenti, migliore è la qualità della visione. La parola d’ordine è: vetro. Alcuni microscopi particolarmente economici montano lenti di plastica ma si tratta di poco più che giocattoli.
Lenti di vetro, quindi, e possibilmente di qualità, affinché siano in grado di correggere quelle distorsioni (dette in gergo scientifico, aberrazioni), che si creano nel passaggio della luce attraverso le lenti. Come abbiamo detto la qualità delle lenti è fondamentale e determinante per il prezzo finale dell’apparecchio. Esistono 3 tipi di lenti che vengono montate sugli obiettivi: acromatiche, apocromatiche, semiapocromatiche (alla fluorite)
| Tipo di lente | Caratteristiche | Costo |
|---|---|---|
| acromatica | non corregge le aberrazioni | economico |
| apocromatica | corregge tutte le aberrazioni | elevato |
| semiapocromatica (alla fluorite) | corregge buona parte delle aberrazioni | medio |
Quanti ingrandimenti si raggiungono con questo tipo di microscopio?
Come abbiamo detto, il microscopio a fluorescenza, è un microscopio ottico dotato di una lampada particolare in grado di evidenziare le fluorescenze presenti nei campioni trattati. L’ingrandimento raggiungibile , quindi, è lo stesso di un microscopio ottico meccanico tradizionale.
L’ingrandimento totale si ottiene moltiplicando la capacità di ingrandimento dell’obiettivo con quella dell’oculare. Con un oculare 10x (si legge 10 per) e un obiettivo 100x, si ottiene un ingrandimento di 1000x (10×100=1000).
Ciò significa che si vedrà l’oggetto ingrandito di 1000 volte, il massimo ottenibile con un microscopio ottico con oculare standard 10x. Solo alcuni apparecchi di alta gamma sono dotati di lenti 15x, o anche 20x. In questi casi si possono raggiungere i 1500 ingrandimenti ma è necessario essere dotati di uno strumento professionale. L’obiettivo, invece, va da 4x a 100x. La maggior parte dei microscopi è dotata dei 3 obiettivi classici: 10x, 40x; 100x Ogni obiettivo è identificato da una fascetta di colore diverso. Per convenzione il 10x è giallo; il 40x è azzurro; il 100 x è bianco. Alcuni microscopi sono dotati anche di un obiettivo 4x identificato dal colore rosso.
| Oculare | Oobiettivo | Ingrandimento totale |
|---|---|---|
| 10x | 4x | 40x |
| 10x | 10x | 100x |
| 10x | 40x | 400x |
| 10x | 100x | 1000x |
Come usarlo?
Il microscopio ottico a fluorescenza viene utilizzato, per lo più, in biologia e all’interno di laboratori specializzati. Ciò per diverse ragioni. Il prezzo, prima di tutto, notevolmente superiore a quello di un tradizionale microscopio ottico; ma anche a causa delle precauzioni da prendere per la gestione dei materiali e per la sicurezza dell’osservatore. Come abbiamo visto, la luce ultravioletta è estremamente pericolosa per la vista.
Altrettanta precauzione è necessario applicare nell’utilizzo del materiale fluorescente. La fluorite, infatti, è molto tossica. Oltre ad essere velenosi, questi minerali sono anche molto delicati; perché mantengano le proprietà fluorescenti, devono essere conservati al buio.
Nel momento in cui vengono utilizzati per l’osservazione, inoltre, non devono essere lasciati troppo a lungo a contatto con la luce emessa dal microscopio altrimenti si rischia di incorrere in un fenomeno noto ai biologi, detto bleaching (in italiano sbiancamento). Se esposto ai raggi ultravioletti per un tempo prolungato, in altre parole, il campione trattato perde la fluorescenza. In conclusione, questo tipo di microscopio non è consigliato per i bambini e, in caso di uso domestico, è indispensabile maneggiare, sia l’apparecchio che gli accessori, con estrema cura.
